SHFY-NSM-幽门螺杆菌的生化反应及其尿素酶

  • SHFY-NSM-幽门螺杆菌的生化反应及其尿素酶

Hp对临床微生物学实验室中常用于鉴定肠道细菌的大多数经典生化实验不起反应。McNulty等人试验了大量Hp菌株的许多种预成酶(preformed enzyme),发现Hp能产生氧化酶、触酶、尿素酶、碱性磷酸酶、γ-谷氨酰转肽酶、亮氨酸胺肽酶和DNA酶,它们是高度同源性的一族。而它们对其他8种氨肽酶、2种脂酶、8种糖苷酶、18种单糖发酵酶、9种其他酶均不起反应,因此前述7种酶的测定可以作为Hp生化鉴定的依据,但这些酶的测定对Hp的生物分型毫无帮助。

尿素酶是一种人和动物胃肠道及泌尿道感染病原菌经常分泌的酶,它既是致病菌的致病因子,又是某些氮源性腐败物转化所必需的酶之一。Hp的尿素酶的理化性状,及其在Hp感染过程中的地位均有其独特性,因此近年来国际上有关尿素酶研究的文献几乎都集中在Hp的尿素酶上。

(l)Hp尿素酶的作用 尿素酶能水解尿素产生氨和氨基甲酸,氨基甲酸随后又自然降解成另一分子氨和碳酸。 在溶液中,释放的碳酸和2分子的氨,又分别平衡成如下的离子式,结果使溶液碱性化。 H2CO3==H+ + HCO3 - 2NH3+2H2O== 2NH+4+2OH-

(2)Hp尿素酶的理化性状 Hp尿素酶的Mr为380000~600000,它的比活性(specific activity)在1.100~3.l89U/mg。Km值为0.17mM,pI=5.9[21],最适温度45℃、最适pH8.2。阳离子对Hp尿素酶活性的释放和稳定性作用如下[22]:在分别含l.5或10mM Ca++、Mg++、K+、Na+、EDTA或EGTA的水溶液中加温部分纯化的Hp尿素酶,结果对其活性丝毫没有影响;反之,在1mM的Fe+++、Ca++、Co++或Zn++则可抑制其大部分活性(>80%)。10mMFe++、Mn++和Ni++约抑制其30%的活性,加入Ca++或Mg++,可显著地降低用水从完整Hp对尿素酶的抽提率。在4℃,酶活性的稳定性因加入甘油或2-Mercaptoethanol而加强;但是,即使活性丧失后,其抗原性仍然保留。现在除了上述某些二价阳离子对Hp尿素酶有抑制作用外,尚有三类物质:氧肟酸〈Hydroxamic acid〉,磷酸氨基化合物(Phosphoroamide compounds),巯基化合物(Thiol compounds)可能对其有抑制作用。

(3)Hp尿素酶与胃十二指肠疾病的关系

① Hp借尿素分解产生氨中和了Hp周围的酸,从而使Hp能在胃腔中生存和定居。利用Hp尿素酶阴性突变株,已在悉生小猪动物模型中证明尿素酶对定居是必需的。

② 对宿主的直接毒性作用,有证据表明尿素水解产生的氢氧化氨可直接导致明显的组织损害。必须强调的是氨离子本身没有毒性,主要是氨与水平衡后产生的氢氧离子的组织毒性。氨还可以干扰正常的氢离子返扩散(back-diffusion),导致上皮细胞下的细胞毒性损害。

③ Hp尿素酶还可能通过多种机制(中性粒细胞、单核细胞的呼吸爆发作用,趋化作用,激活细胞免疫等)导致黏膜局部炎症病损。纯化的尿素酶可以诱导致炎症改变的细胞因子的分泌,而且,尿素酶还可以进而诱导白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子的分泌,但不会导致白细胞介素8(IL-8)的分泌。

④ 尿素酶是Hp最重要的抗原之一,它可以引起Hp感染病人和动物血清中抗Hp-IgG和IgA的升高,也可利用它做抗原通过血清学反应诊断Hp感染,监测抗Hp疗效和进行流行病学调查。 (4) Hp尿素酶的临床应用 目前根据尿素酶水解尿素的作用原理以及尿素酶基因序列,已经衍化出许多诊断Hp感染的方法。

归纳起来,主要有以下几类:

① 快速尿素酶试验 这是目前临床应用最普遍的一种方法,通过胃黏膜活检标本初步判断是否有Hp感染的简易方法。目前市场上销售的制剂类型有许多种,它的缺点是检测结果易受胃黏膜表面Hp分布不均影响,再加上制剂生产标准不统一,易受观察结果时温度和时间因素的影响。而且上消化道中还存在很多其他可以产生尿素酶的微生物,从而导致假阳性结果。但它仍不失为初步筛选Hp感染的最简易手段。

② 尿素呼气试验 它是一类非侵袭性Hp感染诊断方法,可分为两种。用稳定性同位素l3C标记尿素的称作13CO2呼气试验。用放射性同位素l4C标记尿素的称作为14CO2呼气试验。这两种方法分别用不同碳元素标记的尿素让测试者口服,然后过一定时间后检测呼出气体中的13CO2或14CO2,前者应用质谱仪检测,后者可用液体闪烁扫描仪检测。

③ 15N-尿氨排出试验 这也是一种同位素示踪试验,其性质同13CO2呼气试验,其不同点在于用稳定性同位素15N标记的尿素,供被测者口服,然后收集一定时间内的尿样,检测其l5N-尿氨的排出率。在这种试验中对尿样的检测亦需用质谱仪。

④ PCR试验 由于尿素酶是Hp中普遍存在的,因此尿素酶的基因序列特别适于作Hp DNA鉴定的靶标,用ureA、ureB基因序列的相应引物进行特异目的DNA片段的PCR检测,特异性与敏感性均极高。 但对于实验室条件和操作人员要求较高,如果在非标准条件下利用这一方法进行检测,有可能会出现悬殊的结果偏差,特别是假阳性结果的大量出现。故目前不建议用于临床的Hp感染检测。

⑤ 基于尿素酶的PCR分型系统 在不同Hp间,尿素酶基因DNA序列的独特性决定了限制性内切酶酶切部位不同,使用限制性内切酶酶切后可以产生不同的酶切图谱,几乎每一菌株株显示一种式样。现在利用限制性内切酶对尿素酶基因PCR产物进行酶切,这使Hp根据基因差异分型成为可能[21]。而且可以把它用于:a.根据不同的琼脂糖凝胶电泳图谱鉴别不同Hp菌株;b.对在同一活检标本中出现的不同菌株进行鉴别;c.在根除Hp治疗后判断是复发还是再感染;d.鉴别来自不同家庭成员中的Hp菌株,以判断细菌的传播情况。

⑥ Hp尿素酶疫苗的研制 用尿素酶作为免疫原进行免疫接种的想法已经提出很长时间了。1946年诺贝尔奖获得者J.B.Sumner在他的早年工作中,首先把刀豆尿素酶结晶化,并证明以这种酶作为抗原,可剌激产生强烈的免疫球蛋白反应。近来用尿素酶作疫苗的研究,已经越来越明显地聚集在预防胃炎、消化性溃荡和通过预防Hp感染来减少胃癌的发病风险。但是由于建立动物模型的困难,前一时期主要还是集中在用H.felis在小鼠身上进行研究。1995年Marchetti首先成功地用Hp在小鼠身上建立了Hp感染的动物模型,随后,澳大利亚Lee.A等人也建立了一成熟的Hp感染的小鼠模型,同时也出现了Hp感染大鼠的动物模型[30]。这些必要的基础工作必将大大地加速和促进Hp感染疫苗的研制进程。另外,Hp的疫苗研究中,免疫原的选择也并不仅仅局限于尿素酶,针对其他成分,特别是全菌超声裂解物的研究也在进行中,而且取得了令人鼓舞的进展。研究结果显示不仅可以预防Hp的感染,而且可以清除已有的感染。

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幽门螺杆菌
编撰
王洪涛 张振华