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幽门螺杆菌感染的免疫防治

免疫接种是预防和控制感染性疾病最经济而有效的方法。疫苗通过有效地调动机体的免疫系统,克服细菌对宿主的免疫逃避来达到预防感染和消除已感染细菌的目的,经济而简便,可在人群中大规模运用,并且对耐药细菌仍然有效。鉴于H.Pylori感染的高发病率及其与慢性胃炎,消化性溃疡以及胃癌、胃黏膜相关性淋巴组织淋巴瘤的密切关系,如何通过免疫接种达到防治这些疾病的目的,一直是各国科研人员关注的问题。


对H.Pylori疫苗的研究始于90年代初。1991 年,Czinn及Nedrud首次进行免疫预防方面的动物实验,他们给小鼠灌喂H.Pylori全菌粉碎抗原,有些小鼠同时辅以黏膜佐剂霍乱毒素(Cholera toxin, CT),结果发现与对照组相比,那些给予抗原加CT的动物血清IgA增加5倍,肠分泌液中IgA增加16倍。用雪貂研究也观察到类似结果,这些结果提示建立一种免疫接种方法以预防H.Pylori感染及其相关疾病是有可能的[1]。随后Chen等通过猫胃螺杆菌(H. felis)/小鼠模型验证了这一假设,以H. felis超声粉碎抗原加CT 免疫小鼠,再用H. felis活菌攻击,结果发现免疫后的小鼠获得95%的保护率 [2]。随后各国研究人员在H.Pylori疫苗及相关免疫机制方面作了大量探索,并取得了不少的结果。

on Tuesday March 27 by Soloman

幽门螺杆菌感染免疫致病机理

从细菌在胃黏膜上皮的黏附定居开始,机体的免疫系统即被激活。H.Pylori全菌、鞭毛蛋白、脂多糖、尿素酶及空泡毒素、毒素相关基因致病岛、中性粒细胞活化蛋白等多种成分均可作为免疫原,导致机体的免疫应答,导致胃黏膜免疫病理损伤。


(一)体液免疫介导的免疫病理损伤
H.Pylori特异性体液免疫表现为感染局部和全身性抗H.Pylori抗体增加,包括IgG、和。IgA和IgG可激活补体,趋化粒-单细胞在感染部位聚集,释放炎症介质及氧自由基等损伤胃上皮细胞,产生免疫损伤[3、4];IgE通过刺激肥大细胞释放组胺等介质而引发黏膜急性变态反应,产生免疫病理损伤[3、5]。某些H.Pylori的抗原成分和胃黏膜上皮组织抗原结构相似,通过“分子模拟”刺激与胃黏膜上皮细胞或壁细胞发生交叉反应的抗体生成,导致自身免疫损伤[6,7]。


(二)细胞免疫介导的免疫病理损伤
H.Pylori感染诱导的细胞免疫反应表现为包括Th0、Th1和Th2在内的不同辅助性T细胞反应,Th1细胞亚群分泌IL-2、IFN- y、IL-12等细胞因子,辅助B细胞产生具有调理及结合补体功能的IgG2a 抗体;Th2亚群分泌IL-4、IL-5、IL、6、IL-1和IL-13等细胞因子,辅助B细胞生成IgG1、IgA和IgGE,活化肥大细胞引起速发性超敏反应,活化嗜酸性粒细胞清除细菌。Th0亚群同时具有Th1和 Th2亚群的特点,Th1和Th2亚群分泌的细胞因子互相拮抗对方的免疫反应。H.Pylori感染所诱导的细胞免疫反应主要是以Th1型为主的Th1、Th2混合型免疫反应,通过杀伤性T细胞、巨噬细胞和嗜酸性粒细胞消除感染,但在抗感染的同时对感染处周围的组织也造成损伤[8,9,10]。

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动物模型建立

动物模型是研究疫苗的必要条件, 在筛选、评价可作为疫苗的抗原及有效无毒的佐剂等方面,合适的H.Pylori感染动物的模型十分必要,虽然迄今为止没有一种动物模型能完全模拟人类H.Pylori感染,但动物模型仍具有重要作用。由于H.Pylori具有宿主特异性和可能的免疫排斥机制而很难感染一般实验动物,而且感染后的维持时间较短,组织学改变和人类感染的改变不完全相似。早期的动物模型多采用动物螺杆菌感染动物宿主而建立,目前已经感染成功的动物模型有小鼠、裸鼠、大鼠、豚鼠、蒙古沙土鼠、雪貂、悉生乳猪、悉生比格尔犬、猫和猴。


第一个用于疫苗研究的是猫胃螺杆菌(h.felis)/小鼠模型,h.felis与H.Pylori近源,自然定植于猫,能使小鼠产生胃炎,已广泛用于疫苗研制及对H.Pylori感染免疫机理和相关疾病的研究。但此模型不能完全反映人体状态。所引起的小鼠胃炎不同于人体,以胃窦明显而胃炎却一般集中于胃体部,人类H.Pylori感染和胃炎则既见于胃窦也见于胃体部;在疫苗研制中广泛用于小鼠的佐剂如霍乱毒素或大肠杆菌不耐热内毒素(Escherichia coli heat labile toxin, LT)用于人类则可导致严重腹泻;随后出现了鼬鼠螺杆菌(Heliobacter mustelae)/雪貂模型并验证了免疫对于自然感染的治疗效果[11-12]。以后发现某些幽门螺杆菌株能在动物胃内定植,从而建立了直接感染幽门螺杆菌的动物模型[13],这种模型的最大优点在于所感染的细菌本身就是人类病原菌。悉生比格尔犬感染小鼠适应性(mouse-adapted)H.Pylori后,胃病理变化和某些临床表现如急性感染出现的呕吐和腹泻等与人类非常相似[14]。一些灵长类动物和人一样可自然感染H.Pylori,病理变化和人类相似,对重组抗原和佐剂的反应与人体相似,这两种模型提供了用于疫苗研制和筛选的有利工具。其他动物模型包括大鼠、悉生小猪(Gnotobiotic piglets)、蒙古沙土鼠(Mongolian gerbils)、豚鼠、猫,以及灵长类动物如恒河猴(Rhesus monkey)、鼠猴(Squirrel monkey)[15,16,17]也随后建立,并在疫苗研制中各有其应用价值。随着基因改造动物的出现和应用,目前有许多实验采用基因剔除小鼠或转基因小鼠为模型,这更有助于阐明H.Pylori感染和免疫保护的特异性机制[18,19,20]。

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疫苗构建

H.Pylori的感染是慢性感染,在长期的进化中,H.Pylori已经形成了自己独特的生理习性和特殊的防御机制,可有效的耐受自然感染诱导的免疫反应,不仅使自己免于被清除,而且可导致更重的免疫病理损伤[21]。因此,必须利用不同佐剂配合H.Pylori的抗原来预防和治疗H.Pylori感染。H.Pylori疫苗研制的关键在于选择最具保护力并对人体无害的抗原,以及合适的方法将这些抗原成分有效地呈递给宿主的免疫系统,从而在胃黏膜诱发保护性免疫反应。


(一) 减毒幽门螺杆菌疫苗
有效的减毒活疫苗曾成功地用于预防脊髓灰质炎,霍乱,伤寒等疾病,但对于H.Pylori则存在如下问题:①野生H.Pylori感染所诱导的免疫反应没有保护作用,减毒活菌苗诱导免疫反应的能力更弱,甚至可能诱导免疫逃避或耐受;②减毒活菌苗需要高剂量和重复接种才有效,而H.Pylori大量培养较为困难,用于大规模免疫接种在经济上也不可行;③减毒活菌苗仍然可能对宿主造成持续性慢性感染;④减毒活菌苗可以诱导出对众多H.Pylori抗原的免疫反应,由于可能和某些人体抗原产生交叉免疫而导致自身免疫损伤。基于这些原因,减毒H.Pylori疫苗不大可能用于人体。


(二)亚单位疫苗
粗制全菌抗原在早期疫苗研究中曾广泛使用,其好处在于可将多种抗原呈递给机体而无需分离、鉴定及纯化各抗原组分,但考虑人体组织和H.Pylori抗原间可能有的交叉免疫反应 ,这种粗制全菌抗原不适用于人体接种,目前多在探索H.Pylori免疫机制的动物模型中应用。由纯化抗原加佐剂构成的亚单位疫苗是研究最多并有希望应用于人体的疫苗。可作为疫苗组分的抗原必须满足以下条件:①在不同的H.Pylori菌株中高度保守;②能够大规模生产和纯化;③和人体组织不产生交叉免疫; ④无毒; ⑤单独使用时有保护效应,和其他保护性抗原合用可产生协同作用。研究最早也最多的抗原为尿素酶。尿素酶是H.Pylori重要的毒力因子之一,约占细菌所有可溶性蛋白的6%并可表达于菌体表面,在酸性环境下稳定故可口服,而且在H.Pylori不同菌株中高度保守。1994年Michetti等报道纯化尿素酶加CT免疫小鼠后对H. felis 的攻击有70%的保护作用[22], 随后由于尿素酶基因的克隆,重组尿素酶的生产成功,大量的动物实验证明了这一抗原的保护作用及安全性,包括在灵长类动物的实验,从而使其成为目前最被看好的疫苗候选者。H.Pylori其他抗原如热休克蛋白、空泡毒素及毒素相关蛋白、粘附素、过氧化氢酶、外膜蛋白、触酶及中性粒细胞活化蛋白的免疫保护作用也有实验报道,和黏膜佐剂(CT 或LT) 合用,在小鼠可达80%~90%的保护率[23,24,25,26,27]。由于热休克蛋白可能和人体抗原有交叉免疫,而毒素相关蛋白和空泡毒素因其细胞毒性而且仅在CagA+和VacA+的菌株中表达,从而将限制其作为疫苗应用于人体。单一抗原成分的亚单位疫苗往往不能达到满意的保护率,而联合应用两种或以上抗原成分的多价疫苗则具有比单价疫苗更好的保护作用。Ferrero等证明由热休克蛋白A亚单位和尿素酶B亚单位组合的疫苗在小鼠模型中对H. felis攻击可达100%保护率[28]。Ghiara等报道空泡细胞毒素 (VacA)和尿素酶联合应用佐剂大肠杆菌不耐热肠毒素 (LT)口服免疫, 对小鼠的保护率同样达到100% ,单独应用VacA的对照组仅有80%的保护率,尿素酶和热休克蛋白合用给小鼠口服免疫 ,保护率达100%而分开接种不能达到这个保护率。热休克蛋白A亚单位和尿酶B亚单位联合免疫的保护率可达 100 %, 单独应用热休克蛋白亚单位A或B仅有 50 %的保护率[29]。
实验证明只有当H.Pylori抗原与一种佐剂一起接种时才具有保护作用,单纯抗原免疫无保护作用。佐剂实际上是一种免疫调节剂,有研究表明不同的佐剂可以诱导不同的TH反应[30]。在亚单位疫苗的研制过程中高效无毒佐剂的筛选是一个难点。到目前为止绝大多数成功的动物实验中使用的佐剂为CT,出于安全性的考虑,CT不可能用于人体免疫。LT毒性较CT低,许多报道采用LT作为替代佐剂也获得成功。在一个小规模临床实验中,LT作为佐剂也能被人体耐受[31]。CT和LT均由A和B亚单位组成,A亚单位具肠毒性但也具强佐剂作用,B亚单位无毒但佐剂作用也较弱。有研究者采用高剂量B亚单位加低剂量A亚单位的方法进行免疫以达到减低佐剂毒性而保留佐剂活性的效果[32-33];另一些研究则试图通过对CT或LT某些氨基酸位点的改变去其毒性而保留佐剂活性。Marchetti等首先报道了采用无毒的变异LT(LTK63,即在63位上用赖氨酸取代色氨酸)为佐剂在H.Pylori/小鼠模型取得成功 [34]。Kim 等构建了H.Pylori黏附素(adhesin)与霍乱毒素A2和B亚单位嵌合表达质粒,在大肠杆菌中表达后分离纯化融合蛋白。口服免疫小鼠较单独口服黏附素相比可诱导更高水平的黏膜IgA和血清IgG抗体反应,62.5%的小鼠得到保护,免受H.PYLORI SS1菌的攻击[35])。 国内李明峰等用PCR方法将hspA和ctxB基因片段, 克隆在含T7启动子pET - 22b(+)表达载体中, 重组的融合蛋白和HspA共同标记同位素I125, 然后给小鼠灌胃, 结果观察到HCT组小鼠血清中的I125的放射量要明显高于HspA组(P<0.001), 且吸收峰值时间明显提前。融合蛋白中的CtxB可明显促进小鼠对HspA的吸收。这些结果表明CTA2/B可作为一种有效的免疫佐剂增强与其嵌合的抗原的免疫反应[36]。抗原和免疫佐剂嵌合构建的融合蛋白疫苗可以作为未来疫苗发展的一个方法。
一些新的候选佐剂如难辨梭状芽孢杆菌的cd毒素、胞壁酸双肽、葡萄糖脂肽、阳离子脂和磷多聚物。Guy将它们与H.PYLORI尿素酶一起皮下注射免疫swiss小鼠,结果显示前两者的佐剂效果与LT相同,后两者效果相对差些 [37]。


(三)载体疫苗和核酸疫苗
由于亚单位疫苗的佐剂问题目前尚无突破性进展,近年来H.Pylori疫苗的另一个发展方向是利用基因重组技术将H.Pylori抗原基因导入载体菌或载体病毒构建能表达H.Pylori抗原的载体疫苗。载体通过胃肠道或其他途径进入人体并不断复制刺激免疫系统,而其表达的H.Pylori抗原则能持续诱导针对H.Pylori的特异性免疫。载体疫苗有许多优点:①由于载体本身可激活免疫系统而无需使用有潜在毒性的佐剂;②载体可同时表达多个外源抗原基因从而可制备多价疫苗;③ 载体疫苗的免疫接种程序较为简便,所需免疫剂量也小;④生产载体疫苗不需纯化蛋白,故也大大简化了疫苗制备程序。目前可采用的载体包括肠道细菌载体如减毒的沙门氏菌、福氏痢疾杆菌或大肠杆菌;病毒载体如痘病毒、腺病毒、脊灰病毒等。国外Corthesy-Theulaz和Gomez-Duarte等先后报道以减毒鼠伤寒沙门氏菌为载体表达H.Pylori尿素酶A和B亚单位抗原制备载体疫苗,用来免疫小鼠,经口免疫获100%保护率,经鼻黏膜免疫获 60%保护率[38,39]。我们也以减毒鼠伤寒沙门氏菌为载体分别构建了表达H.Pylori触酶 (catalase, Kat)、尿素酶A和B亚单位(urea A and ureB)及粘附素(H.pyloriaA)的载体疫苗,同时构建了表达ureA/Kat融合蛋白及ureB/H.pyloriaA融合蛋白的双价疫苗。初步动物实验表明将上述各疫苗经口一次性免疫小鼠分别获得61.5% (Kat)、50% (ureB)、45% (H.pyloriaA)、75% (ureB/H.pyloriaA)保护率(2001年美国消化病学周大会发言)。为验证表达H.Pylori抗原的减毒沙门氏菌载体是否能在人体内诱发特异性抗H.Pylori抗原的免疫应答,Hohmann等先后进行了两个小规模健康人体志愿者试验。在前一个试验中以减毒伤寒沙门氏菌(Salmonella enterica serovar, Typhi) 为载体,后一个试验则以减毒鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella enterica serovar Typhimurium)为载体分别表达H.Pylori尿素酶,然后将载体疫苗经口一次性免疫志愿者。在前者, 8个受试者无一产生抗尿素酶抗体,而后者则6个受试者中有3个产生了抗尿素酶抗体。这说明减毒沙门氏菌的不同血清型作为载体传递外源性抗原的能力有很大差异,但所有受试者均产生了针对载体菌抗原的特异性免疫反应[40,41]。为了进一步增强疫苗的作用,国外学者Harakopakisd等还构建了可以表达佐剂-霍乱毒素CT A2和B亚单位的减毒沙门氏菌,动物实验表明这种疫苗株可以诱导更强时间更长的针对共表达的H.Pylori抗原的分泌性IGA抗体反应以及IgG1/IgG2A混合性抗体反应[42]。CTA2/B可作为减毒沙门氏菌中共表达抗原的佐剂进一步增强减毒沙门氏菌疫苗株的免疫效果。由于载体本身能导致机体的免疫反应,这种抗载体免疫有可能抑制载体疫苗在宿主体内的复制;另外高水平外源抗原的表达对载体的遗传稳定性也可能产生影响,这是制备此种疫苗时需要考虑的问题。


核酸疫苗近10年来发展迅速,这种将编码外源抗原基因的重组质粒直接免疫机体的疫苗已用于病毒、细菌、寄生虫等多种病原体的疫苗研制,有学者认为上述载体疫苗也属于一类特殊的核酸疫苗[43]。1996年Ulivieri等将H.Pylori空泡毒素的一段多肽基因P37克隆入表达质粒构建核酸疫苗,经肌注免疫小鼠后诱发了针对P37的循环抗体应答,但这一疫苗对H.Pylori感染的保护作用没有报道[44]。Isami等构建了H.Pylori的热休克蛋白DNA疫苗pcDNA3-HspB 和HspA,皮下注射10ug免疫C57BL6小鼠,三月后口服108 H.Pylori SS1 菌株攻击,攻击六月后进行组织学和抗体的检测,结果表明DNA疫苗可显著降低细菌在胃黏膜的定植,降低胃黏膜炎症的程度,抗体IgG和IgA显著升高[45] 。还有学者将将H.Pylori尿素酶A和B亚单位克隆到哺乳动物表达载体免疫小鼠,结果H.Pylori尿素酶DNA疫苗免疫小鼠能产生高滴度抗尿素酶血清抗体 ,能保护低度的感染。这些前瞻性的研究结果说明DNA疫苗可能成为未来H.Pylori疫苗的一种新方法。随着对H.Pylori疫苗诱发的保护性免疫机制研究的不断深入,是否可以将一些在保护性免疫应答中发挥关键作用的调节因子克隆入核酸疫苗作为基因佐剂,从而使核酸疫苗发挥更好的免疫保护作用,这是一个值得研究的课题。


( 四)缓释微球疫苗
缓释微球包裹抗原在口服后可以保护H.PYLORI抗原免受胃酸和肠液的变性作用,保持抗原性。持续释放的抗原被小肠淋巴样组织的PP结的M细胞吸收,提呈并活化免疫细胞,经淋巴管道转移至血液循环,分布全身主要的免疫器官和黏膜免疫相关组织。不产生免疫耐受现象。因此可有效的防治H.Pylori的感染。缓释微球广泛采用的聚丙交脂/聚乙交脂(PLGA)能增强免疫反应,有良好的免疫佐剂作用。Kim等利用缓释微球包裹H.Pylori全菌裂解物制备成H.Pylori疫苗小鼠多次口服免疫,。较对照组免疫小鼠小肠黏膜中特异性IGA和血清中特异性IgG明显升高,小肠黏膜PP结抗原特异性抗体形成细胞(ASC)数量明显增多[46]。国内学者王缚鲲等利用聚乳酸与聚乙二醇共聚物(PELA)微粒包囊H.pylori超声上清后对小鼠进行口服免疫也获得了类似的结果。这些结果说明缓释微球包裹抗原疫苗可以作为一种新型疫苗开发来防治H.Pylori的感染。


(五)表位疫苗
抗体分子在抗原上的结合位点称为抗原决定簇 (determinant),又称抗原表位 (epitote),是抗原性质、数目及空间的构型,决定抗原特性,是抗原诱导抗体产生并和抗体结合的主要部位。目前对于H.Pylori抗原表位疫苗也进行了研究。英国学者利用表位作图研究了尿素酶A和B中表位,并合成了其中五个主要的表位并用ELISA法检测H.Pylori感染者的血清,IgM检测的总敏感性、特异性和有效性为52.6%、92.8%和69.6%,表明这些表位具有比较高的特异性和抗原性,可以作为临床检测的指标和疫苗研制的目标。Hiroyuki 等研究发现H.Pylori热休克蛋白的189-203表位在各株和人之间高度保守,利用人工合成的此段多肽加佐剂FCA免疫C57BL/6小鼠,一周后5X105临床分离株TK1402每日三次攻击共攻击两周,定植实验证实用此抗原表位免疫可显著降低H.Pylori的定植率,特异性抗体IgG较对照组明显升高(47)。一般抗原都由多个T细胞和B细胞表位,表位一般由10-12个氨基酸组成,编码基因也只有30-40个碱基。因此可以将一种或/和多种抗原的多个表位融合在一起,这样就可以克服质粒载体容量有限,不能插入表达过大基因的缺点,利于多价DNA疫苗和多价活菌苗的构建。

 

on Tuesday March 27 by Soloman

疫苗接种的途径、剂量、时间以及免疫效果评价

在免疫预防方面已进行了大量动物实验用以确定免疫接种的途径及时间、疫苗的剂量。H.Pylori是一种胃黏膜定植菌,免疫途径方面较多报道的是经口免疫;由于公共黏膜免疫系统的存在,即在一处黏膜接种,所诱导的免疫细胞可到达其他黏膜部位发挥免疫保护作用,因此黏膜免疫途径如经鼻黏膜或直肠黏膜接种也有报道,并获得较好的免疫效果[48]。其他途径包括皮下免疫、腹腔免疫、肌肉注射或联合应用两种免疫途径进行顺序化接种也取得一定效果[49,50]。在动物实验中亚单位疫苗多数采取抗原加佐剂连续接种四次,每次间隔一周的方法进行免疫。 Lee等报道减少抗原剂量和增加免疫间隔时间可获得更好的保护效果[51]。载体疫苗或核酸疫苗一般只需接种一次即可达到免疫效果[38,39]。免疫效果评价通过在免疫结束后不同的时间测定血清或唾液抗H.Pylori特异性抗体滴度,予H.Pylori活菌攻击后观察细菌清除情况(尿素酶实验,定量细菌培养,组织学检查)了解免疫是否有效及免疫保护的持续时间。值得注意的是在许多实验中,免疫接种的保护作用并非是彻底根除胃内H.Pylori,所谓的“完全保护”(即100%不被感染)仅在10%~20%的动物中观察到,但免疫动物和对照相比,其胃内H.Pylori定植密度明显降低。由于H.Pylori致病的主要机制是机体对感染的慢性炎症反应,因此如果能将胃内H.Pylori减少到足够量以至机体不再对其有反应则可能已足以延迟甚至阻止H.Pylori相关疾病的发生,但我们仍希望通过提高疫苗的免疫效果以达到对H.Pylori感染的完全保护。

on Tuesday March 27 by Soloman

疫苗接种治疗幽门螺杆菌感染的动物和初步临床实验

疫苗接种不仅能预防H.Pylori感染,还能治疗感染。1994年Doidge等研究表明用H. felis或H.Pylori全菌粉碎抗原加CT经口接种感染小鼠能清除H. felis感染; 随后Corthesy-Theulas用重组尿素酶B亚单位免疫已感染H. felis 的小鼠也证实了这一意义深远的发现, 这两项实验均未观察到胃部炎症加重的情况[52,53]。 Cuenca等用尿素酶加CT口服免疫长期自然感染鼬鼠螺杆菌的雪貂获得30%的根除率,最重要的是这一实验发现所有接种后的动物,无论感染是否根除,其胃部炎症均明显减轻[54]。1996年Lee等利用恒河猴所作实验证明在H.Pylori感染的灵长类宿主中,口服疫苗能明显减少胃黏膜细菌密度,但不能完全清除细菌[55]。1998年他们再次报道在自然感染幽门螺杆菌的恒河猴中采用重组尿素酶加LT免疫可达31%的完全根除率,同时接种动物的胃部炎症明显减轻[18]。由于对H.Pylori感染者直接观察免疫接种的治疗效果具有巨大的临床意义,1994年在感染H.Pylori的成人志愿者中开始进行免疫治疗的初步临床实验。第一个随机双盲实验由Kreiss等完成,旨在验证单纯口服尿素酶的安全性。12个无症状H.Pylori感染者随机分为两组,一组口服60mg重组尿素酶每周一次共四次,另一组服安慰剂,结果表明尿素酶运用于人体未见明显副作用,但单纯尿素酶免疫前后患者胃黏膜幽门螺杆菌定植密度、炎症及黏膜损害均无任何改变 [56]。第二个临床实验由Michetti等于1999年完成,用于验证尿素酶加LT同时免疫时的治疗效果及安全性。26名无症状感染者随机分为五组,分别给予尿素酶(20、60及180mg)加LT,安慰剂加LT,单纯安慰剂,每周一次共免疫四次。每次免疫后第七天均采血测尿素酶特异性IgA或IgG分泌细胞。开始免疫前和免疫后1月分别取胃黏膜作定量细菌培养测H.Pylori定植密度。结果显示尿素酶加LT组和其他组相比在一个或更多的时间点可见到尿素酶特异性IgA或IgG分泌细胞的增加,而且免疫后尿素酶加LT组的胃黏膜细菌量较免疫前也显著减少(p=0.032)但胃黏膜炎症无变化,而其他各组免疫前后菌量无明显变化(p=0.425)。LT引起的副作用是能被耐受的腹泻,且随免疫次数增加而逐渐减轻。虽然这一实验由于每组例数较少而其结果不足以进行严格的统计学差异性检验,但它的有价值之处在于提供了免疫治疗H.Pylori感染的第一手临床数据[57]。
目前为止,抗H.Pylori疫苗只进行了很少的临床实验,结果还不理想。随着疫苗组分和佐剂量的优化,免疫途径的改善,免疫机制的阐明,未来的临床实验会取得满意的效果。

on Tuesday March 27 by Soloman

保护性免疫机制和免疫后炎症

保护性免疫机制和免疫后炎症 自然感染H.Pylori后的免疫反应并不能清除细菌,反而由于持续感染导致胃黏膜免疫病理损害。但是大量实验却表明免疫接种可预防甚至治疗H.Pylori感染,这说明在有效的疫苗接种后可诱导机体产生保护性免疫反应,这种保护性免疫反应能够打破H.Pylori与机体之间已建立的一种耐受平衡。体液免疫和细胞免疫都参与了保护机制,目前对此的了解仍不清楚,彻底了解这些机制和疫机理对于免疫防治H.Pylori感染具有重大意义。 (一) 分泌性IgA介导的黏膜免疫反应作为一种黏膜感染,由分泌性IgA (sIgA)介导的黏膜免疫反应一度被认为是一种重要的保护性反应。在H.Pylori疫苗研究中发现免疫后的个体在受到细菌攻击时胃黏膜内可见较对照组明显增高的特异性IgA+B细胞浸润,并伴sIgA 增加。口服抗尿素酶IgA单克隆抗体可保护小鼠不受猫胃螺杆菌感染等研究发现免疫后胃炎的发生取决于细菌攻击时间,免疫后一周是免疫反应的最高峰,体内存在大量的活化淋巴细胞,此时细菌攻击,可刺激这些激活的淋巴细胞聚集在感染部位,造成损伤,推迟攻击时间到免疫后四周,此时免疫反应明显减弱,活化的淋巴细胞转变为记忆细胞,此时攻击免疫后胃炎明显减轻。另外我们在研究中也发现不同的攻击菌量引起的胃黏膜炎症程度不一样。大菌量可导致明显免疫/炎性细胞在胃黏膜下层的积聚,而小菌量则基本上不出现免疫/炎性细胞的积聚。另外前述免疫个体出现的TH2反应也许应理解为机体对伴随TH1反应而出现的炎症损伤的平衡机制,这一平衡机制有助于将抗H.Pylori感染免疫所导致的胃炎减小到一定程度而并不直接发挥抗感染作用。 当然到目前为止对疫苗接种后的保护性免疫机制和免疫后炎症的研究尚无一个肯定结论,多数的研究结论均来自一些短期观察,也许一种长期的和动态的观察将有助于我们更全面地理解和评价这其中的内在联系。

自然感染H.Pylori后的免疫反应并不能清除细菌,反而由于持续感染导致胃黏膜免疫病理损害。但是大量实验却表明免疫接种可预防甚至治疗H.Pylori感染,这说明在有效的疫苗接种后可诱导机体产生保护性免疫反应,这种保护性免疫反应能够打破H.Pylori与机体之间已建立的一种耐受平衡。体液免疫和细胞免疫都参与了保护机制,目前对此的了解仍不清楚,彻底了解这些机制和疫机理对于免疫防治H.Pylori感染具有重大意义。


(一) 分泌性IgA介导的黏膜免疫反应
作为一种黏膜感染,由分泌性IgA (sIgA)介导的黏膜免疫反应一度被认为是一种重要的保护性反应。在H.Pylori疫苗研究中发现免疫后的个体在受到细菌攻击时胃黏膜内可见较对照组明显增高的特异性IgA+B细胞浸润,并伴sIgA 增加。口服抗尿素酶IgA单克隆抗体可保护小鼠不受猫胃螺杆菌感染[58,59,60]。但随着基因改造动物在疫苗研制和免疫机理研究中的应用,这一观点受到了质疑。1998年Ermak等利用基因剔除小鼠作的免疫预防研究发现B细胞缺乏的小鼠予尿素酶加LT免疫后虽然胃黏膜内并无IgA+B细胞存在,但对幽门螺杆菌攻击仍具保护作用,而且免疫鼠胃黏膜内出现较多CD4+T细胞,据此认为免疫保护不需抗体介导,而是由受MHCII类抗原限制的CD4+T细胞介导的细胞免疫发生作用[20]。Sutton等用B细胞缺乏小鼠作H.Pylori感染的免疫治疗实验发现细菌的根除也并不依赖抗体的产生[61]。在人体方面Bogstedt等观察发现IgA缺失症患者的H.Pylori感染率与相同年龄的正常人相比并无明显增高,也证明分泌性IgA在抗H.Pylori感染免疫中并不是必要的[60]。Ciznn等的研究也发现可能是IgG而不是IgA产生保护作用[62]:,因此全身免疫对预防感染也有一定的作用。


(二)辅助性T淋巴细胞反应
T细胞根据其表面分化抗原(CD)的表达可分为CD4+和CD8+T细胞。已有的报道表明在H.Pylori感染的保护性免疫中起关键作用的是CD4+T辅助细胞[20,63]。许多研究均指出,无论在动物还是在人体内,自然H.Pylori感染均导致TH1型免疫应答,表现为胃黏膜组织内特异性CD4+T细胞增加,T细胞产生IL-2、IFN-γ、IL-12等细胞因子增加 [64,65] 。TH1细胞通过其分泌的细胞因子,尤其是IFN-γ导致胃黏膜炎症损伤甚至溃疡。实验证明对感染H.Pylori的小鼠用IL-12治疗或输入TH1细胞,可加重胃部炎症,反之予抗IFN-γ单抗治疗则可使炎症减轻。缺乏IFN-γ基因的小鼠感染H.Pylori后不产生炎症反应[18,19,66]。Mohammedi等体外用螺杆菌反复刺激感染了H. felis的小鼠脾细胞,发现有TH1型细胞因子产生,而无TH2型细胞因子因子;将H.Pylori特异性TH1和TH2细胞分别被动免疫小鼠后再以H. felis攻击,结果发现接受TH2细胞免疫的小鼠胃细菌定植密度较接受TH1细胞免疫者明显降低[19]。这些支持免疫保护作用主要为TH2型反应介导。然而Kathryn等用联合免疫缺陷 (SCID)小鼠所做的另一个被动免疫实验却证明将感染或未感染H.Pylori的C57BL/6小鼠脾淋巴细胞输入H.Pylori感染的SCID小鼠后,在其胃黏膜导致了较供体鼠更严重的胃炎和迟发性超敏反应(DTH),同时伴有胃H.Pylori的减少[67],这说明保护性免疫来自于TH1反应,而且如前所述这种TH1反应在抗感染的同时也造成炎症性组织损伤。近期发表的利用细胞因子基因剔除小鼠作的研究发现IFN-γ 缺乏小鼠对H.Pylori感染无抵抗力而IL-4缺乏小鼠则仍对H.Pylori感染有部分抵抗力[68]。 Jiang等对H. felis感染小鼠接种腺病毒, 结果证明病毒本身即可对H. felis感染有部份根除作用,而对缺乏IFN-γ和IL-12基因剔除鼠则无效,提示保护作用来自于依赖IFN-γ和IL-12的TH1反应[69]。Nedrud等用H.Pylori抗原免疫小鼠,用佛氏佐剂诱发TH1反应,用明矾佐剂诱发TH2反应,均对小鼠有保护性免疫[70]。最近我们在对减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗的保护作用进行研究的动物实验中也发现减毒鼠伤寒沙门氏菌载体本身对H.Pylori感染也有部分保护作用,这种保护作用一方面来自于鼠伤寒沙门氏菌和H.Pylori之间可能存在的交叉免疫反应[39],另一方面更重要的是我们发现减毒鼠伤寒沙门氏菌载体可在免疫鼠的胃黏膜部位诱发出比单纯H.Pylori感染时更强的TH1反应,而这种反应在免疫鼠胃黏膜H.Pylori量减少后即有减弱趋势。综上所述我们推测疫苗的免疫保护作用仍然主要来自TH1反应,自然感染和免疫接种诱导的TH1反应在本质上并无区别,有区别的可能只是这种反应在自然感染和免疫接种两种不同的情况下其强度和持续时间不一样,因而所产生的后果也不一样。在H.Pylori疫苗研制中一个值得注意的现象是迄今为止所有证明有效的疫苗都存在佐剂依赖性或载体依赖性,而佐剂或载体的重要意义也许就来自于这种“定向”TH免疫调节作用。TH1和TH2型反应都能刺激保护性免疫,混合型TH反应要达到最佳平衡即保护了胃黏膜免受感染又避免了过激的免疫损伤,这样才能取得满意的免疫效果。


(三)免疫后炎症
在利用H.Pylori疫苗所做的预防性免疫实验中不少作者报道了免疫后炎症这一现象,即免疫动物受到H.Pylori攻击后出现较单纯感染对照更为严重的胃炎[18,19,60,71],这也引起人们对幽门螺杆菌疫苗是否能用于人体的担忧。但迄今为止在治疗性免疫接种实验中却鲜有这类报道,包括前述人体临床试验[52,53,54,56,57,]。对免疫后炎症的一种解释是由于免疫反应未能彻底清除攻击细菌,残存的细菌导致了炎症的发生,一旦用药物根除掉残存细菌,炎症也随之消失[59]。然而残存细菌是否能完全解释这种比单纯感染对照更为严重的胃炎?因为残存细菌的量毕竟比感染对照少。通过对前面T辅助细胞在保护性免疫中的作用的讨论,我们认为免疫后炎症是TH1反应时的一种表现,当免疫个体受到大量H.Pylori攻击时,TH1反应产生的细胞因子可激活大量的免疫/炎性细胞聚集到胃黏膜, 过强的免疫反应使细菌得以清除的同时也会造成炎性组织损伤,而后随着细菌的清除,TH1反应减弱,炎症将逐渐消失[76]。因为目前大多数免疫预防实验所采用的攻击菌量均大大超过自然感染菌量,而且免疫后细菌攻击时间过早,故而免疫后炎症在预防性免疫实验中报道较多。Lee[72]等研究发现免疫后胃炎的发生取决于细菌攻击时间,免疫后一周是免疫反应的最高峰,体内存在大量的活化淋巴细胞,此时细菌攻击,可刺激这些激活的淋巴细胞聚集在感染部位,造成损伤,推迟攻击时间到免疫后四周,此时免疫反应明显减弱,活化的淋巴细胞转变为记忆细胞,此时攻击免疫后胃炎明显减轻。另外我们在研究中也发现不同的攻击菌量引起的胃黏膜炎症程度不一样。大菌量可导致明显免疫/炎性细胞在胃黏膜下层的积聚,而小菌量则基本上不出现免疫/炎性细胞的积聚。另外前述免疫个体出现的TH2反应也许应理解为机体对伴随TH1反应而出现的炎症损伤的平衡机制,这一平衡机制有助于将抗H.Pylori感染免疫所导致的胃炎减小到一定程度而并不直接发挥抗感染作用。


当然到目前为止对疫苗接种后的保护性免疫机制和免疫后炎症的研究尚无一个肯定结论,多数的研究结论均来自一些短期观察,也许一种长期的和动态的观察将有助于我们更全面地理解和评价这其中的内在联系。

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问题和展望

对H.Pylori感染的免疫防治虽已进行了大量研究并取得了令人瞩目的成果,但尚有许多问题有待解决。筛选最佳抗原或抗原组合及无毒高效的佐剂,发展无需佐剂的疫苗如活载体疫苗或核酸疫苗,联合不同类型疫苗进行免疫,确定最佳免疫剂量、时间及接种年龄,确定简便有效的免疫途径;疫苗和药物联合使用治疗H.Pylori感染等都还有大量工作需要去做。H.Pylori与宿主之间复杂的相互作用,免疫接种后的保护性反应机理以及所涉及的不同免疫细胞的功能等都还需深入探讨。筛选最佳抗原或抗原组合是研制有效疫苗的关键。1997年,Tomb等测定了H.Pylori(26695菌株)完整的基因序列,随后MacAtee等应用“蛋白组”技术,即联合应用双向凝胶电泳和Western印迹法快速分离鉴定H.Pylori的抗原,并将分离出的抗原蛋白质谱数据与从基因组DNA序列预测者进行比较,从而能很快筛选出有潜在诊疗价值的H.Pylori蛋白及新的疫苗候选抗原 [73,74]。2000年斯坦福大学研制成功了H.Pylori全基因芯片,可以对H.Pylori的序列进行高通量的筛选和分析。这些以基因组为基础的抗原筛选过程大大将加速了疫苗研制进程[75,76]。

 

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