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幽门螺杆菌耐药基因研究与应用现状

幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)是慢性胃部感染最常见的细菌,据统计全球H.pylori感染率约为50%[1, 2],我国人群感染率为60~90%。H.pylori感染是消化性溃疡、慢性胃炎、胃癌和胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤的重要病因。全球指南均推荐确诊H.pylori感染患者考虑进行根除治疗[3, 4]。目前国内外H.pylori根除治疗大多采用质子泵抑制剂(PPI)或/和铋剂联合两种抗生素的三联或/和四联疗法,常用的抗生素包括克拉霉素、阿莫西林、喹诺酮类、呋喃唑酮、甲硝唑、四环素等。然而,随着抗生素在H.pylori根除治疗中的广泛应用,H.pylori耐药率不断升高,导致根除的难度逐渐增加,由最初的大于90%的根除率到近期的甚至低于60%[5]。有鉴于此,近年来在H.pylori根除治疗上,特别是首次治疗失败后,采用四联疗法(PPI,铋剂或中成药等,上述2种抗生素)取得了一定的疗效。


(一)幽门螺杆菌耐药分子机制
据统计,2007年我国H.pylori对抗生素耐药率分别为:克拉霉素0~40%(平均23.9%),甲硝唑50~100%(平均73.3%),阿莫西林0~2.7%,喹诺酮类 0~26.6%。H.pylori对抗生素耐药主要是各抗生素靶基因的突变所致(表1),同时也与外排泵和孔道蛋白等改变有关。目前除了呋喃唑酮耐药机制不是很明确外,克拉霉素、四环素、甲硝唑、阿莫西林和喹诺酮类等抗生素耐药机制较为明确。H.pylori对抗生素耐药性一般与突变位点数呈正比,即突变位点数越多,耐药性越强。单个位点突变多数导致低水平耐药,而多个位点突变导致中度或高度耐药,特别是克拉霉素基本可以依据突变数量确定其耐药程度。
1.克拉霉素
克拉霉素是H.pylori根除治疗中最常用的抗生素,对它的耐药直接影响着 H.pylori根除的成败。克拉霉素能进入细胞内与H.pylori的23S rRNA V区结合,影响核糖体的移位过程,从而抑制蛋白合成。如23S rRNA V区发生突变,将会引起核糖体构象发生改变,进而与克拉霉素的亲合力减弱,导致克拉霉素不能有效地阻止H.pylori的蛋白合成,最终产生耐药。结合文献资料和NCBI dataBase,目前H.pylori 23S rRNA V区的突变位点数已超过25个,其中常见的突变有A2143G、T2182C和A2142G等。在耐克拉霉素H.pylori菌株中,携带多个23S rRNA突变的现象较为常见,并且携带多个突变的H.pylori的克拉霉素MIC通常高于携带单个突变的H.pylori[6]。同时,笔者对三联/四联疗法失败的H.pylori感染者的胃黏膜分析发现,每个患者H.pylori菌株均含有至少2个突变,携带3~4个突变也很常见,提示携带多个23S rRNA基因突变将导致H.pylori对克拉霉素高度耐药,是H.pylori根除治疗失败的重要因素。


2.喹诺酮类抗生素
喹诺酮类抗生素通常是作为H.pylori感染二线用药,也可以用于一线用药。H.pylori对喹诺酮类抗生素耐药主要与gyrA基因突变有关,绝大部分是因87Asn和91Asp氨基酸残基改变所致[7-10]。少部分耐药菌株同时携带2个gyrA基因突变,或gyrA和gyrB基因突变各1个。然而,最近Rimbara等发现,单独gyrB基因突变也可引起H.pylori对喹诺酮类抗生素耐药[11]。不携带gyrA和/或gyrB基因突变的耐喹诺酮类的H.pylori比较少见[7, 8]。这些结果提示gyrA基因突变是H.pylori耐喹诺酮类的最主要因素。另外,最近研究显示对氧氟沙星耐药的H.pylori,仍有部分H.pylori对吉米沙星敏感,因此对于氧氟沙星耐药率较高的地区,采用吉米沙星将有助于提高H.pylori根除率[12]。
表4-2 幽门螺杆菌耐药基因及其突变



药物:克拉霉素

基因:23S rRNA

突变:A2142G/C、A2143G、A2144G、T2182C、A2223G、G2224A、C2245T和T2289C等



药物:阿莫西林

基因:PBP1、PBP2、PBP3

突变:突变很多,并且耐阿莫西林H.pylori菌株往往含有多个突变



呋喃唑酮

基因:porD、oorD

突变:pord和oorD均突变导致低水平耐药,高度耐药未见报道,具体机制不明确



药物:甲硝唑

基因:rdxA、frxA、frxB

突变:突变很多,frxA和/或frxB基因突变单独并不导致耐药



药物:四环素

基因:16S rRNA

突变:AGA926-928,以TTC耐药性最高


药物:喹诺酮类

基因:gyrA、gyrB

突变:gyrA Asn87Lys/Ile/Thr/Ty、Asp91Asn/Gly/Tyr等



3.其它抗生素
甲硝唑曾经是H.pylori三联疗法中最常使用的抗生素之一,但近年来随着其耐药率急剧升高,目前国内H.pylori根除治疗中已较少使用甲硝唑。甲硝唑耐药主要与rdxA基因突变相关。frxA和frxB基因突变可增强rdxA基因突变所致的甲硝唑耐药性,而单独frxA和frxB基因突变并不导致甲硝唑耐药。阿莫西林是H.pylori根除治疗常用药物,其耐药率在国内各个地区差异极大。阿莫西林耐药主要与PBP1、PBP2和PBP3等3个基因突变相关,并且药敏实验显示,携带1~2个突变的H.pylori表现为低度耐药,而携带多个突变的H.pylori往往表现为高度耐药[13, 14]。四环素耐药与16S rRNA AGA926-928碱基改变有关。药敏实验显示,1~2个碱基突变引起低度耐药,而TTC突变则导致高度耐药[15, 16]。至于呋喃唑酮,目前认为与porD、oorD基因突变有关[17]。


(二)幽门螺杆菌耐药基因型与表型
由于H.pylori耐药机制的复杂性,传统药敏实验是H.pylori耐药检测的最佳选择。然而,由于H.pylori苛刻的培养条件、较长的培养时间和75~90%阳性率,使得H.pylori药敏实验在临床上可操作性很低,导致国内H.pylori根除治疗几乎依据临床经验用药,这也使得国内H.pylori的耐药率不断升高。近年来,随着对H.pylori耐药分子机制研究进展,耐药突变在H.pylori耐药性中的重要性正越来越受到重视。
目前,已经鉴定了很多跟H.pylori耐药相关的基因突变,然而H.pylori耐药基因型与表型不一致现象也给临床医生带来了更大的困惑。这一方面是由于突变检测不全面所引起,另一个重要原因是由于不同耐药突变所致的MIC不尽相同,并且在不同菌株中其MIC也存在差异所致[5]。虽然单个基因突变可引起H.pylori耐药,但大多与H.pylori低度耐药相关。我们对H.pylori根除失败的胃黏膜样本应用H.pylori耐药基因联合检测芯片检测,进一步分析发现所有样本至少含有2个23S rRNA突变位点[5]。由于目前H.pylori根除治疗都采用三联/四联方案,这些单基因突变所致的低度耐药似乎并不完全影响最终临床根除效果。这些结果同时也说明,含多个耐药突变与H.pylori高度耐药相关,可能是H.pylori根除失败的最主要原因。近年来,研究者尝试使用基因型来预测H.pylori耐药性,取得了一定的结果。Liou等研究发现,药敏实验结果与突变检测结果不一致的样本大部分为野生型和突变型的混合菌株,因此通过提高MIC破折点可使这两种检测方法的结果更为一致,并且更符合临床根除效果[18]。最近,Liou等利用突变检测指导难治性H.pylori感染者三线治疗方案,获得了很高的根除率[19]。因此,利用H.pylori基因型指导临床H.pylori治疗是确实可行的,并有可能获得比传统药敏实验更佳的临床根除效果[18, 19]。由于目前这方面的研究很少,尚有待于大规模临床研究证实。


(三)突变检测技术
突变检测是一种常规的分子检测项目,单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism)分型技术均可用于H.pylori耐药突变检测,如传统的测序、TaqMan、PCR-RFLP和DH.PYLORILC,以及高通量基因芯片和二代测序等。与药敏实验相比,突变检测操作比较简单、快速,并且可直接用胃粘膜或大便等样本直接检测,可不需细菌培养。


目前,市场上已有商业化的Real-Time 23S rRNA突变(A2142G/C、A2143G和A2144G)检测试剂盒。然而,考虑到这3个突变均是单独或与其它突变同时存在,以及较低的单个突变耐药预测的准确率[18],使得TaqMan等一次仅能分析几个突变的技术在H.pylori耐药预测方面具有很大的局限性。最近,Liou等利用测序技术对克拉霉素和喹诺酮类耐药突变进行检测,取得了较好的预测效果[18, 19],因此尽可能全面检测相关耐药突变以确保耐药预测的准确性。因甲硝唑、阿莫西林和呋喃唑酮等抗生素耐药基因较大,并且突变数量众多,高通量基因芯片和新一代测序是H.pylori耐药检测的最佳选择。我们成功地构建了H.pylori耐药基因联合检测芯片[20],并在国内H.pylori学组组织的“荆花胃康联合PPI三联根除治疗H.pylori全国多中心研究项目”中,对H.pylori根除失败的胃粘膜样本进行了初步检测,60例治疗失败患者的胃黏膜H.pylori菌株对克拉霉素和阿莫西林的耐药基因检出率分别为60.0%( 36/60)和18.3% (11/60) [5]。该芯片结果与标准培养结果的大样本对照研究正在进行。然而,基因芯片和新一代测序在H.pylori耐药检测中的临床应用尚有待时日。因克拉霉素、喹诺酮类和四环素等相关耐药基因片段小,传统测序可能是目前这三个药物耐药检测最合适的技术。


(四)展望
H.pylori根除治疗成败主要受宿主和细菌两个因素的影响,并且目前H.pylori治疗时采用PPI和/或铋剂联合两种抗生素的三联或四联疗法,基因突变所致的低度耐药未必会造成临床上的耐药。因此,单纯凭借药敏实验确定耐药突变是否耐药,必然导致基因型预测结果与临床根除效果的高度不一致性。结合药敏实验,通过基因型与临床根除效果的一致性来确定耐药突变判断标准更为合适[21]。虽然,目前有很多H.pylori基因型与表型的文献报道,但基因型与临床根除效果之间的相关性的文献报道屈指可数。因此,迫切需要组织大规模的临床实验,探讨H.pylori耐药基因突变检测在临床中的应用的可行性。


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