H.pylori感染后除药物根除和最终发展成萎缩性胃炎或胃癌外,会终生带菌,因此血清学方法检测H.pylori抗体阳性应认为存在活动性感染。然而,由于H.pylori根除后,血清中抗体水平在半年或更长时间内内仍可维持阳性,故血清学检测结果通常不能区分病人为现症感染还是过去感染,因此,不能用于评价药物治疗后的效果,实际上该方法常用于人群中H.pylori感染情况的流行病学调查。
临床上常用的血清学检测方法为酶联免疫吸附技术,所用抗原有纯化抗原、部分纯化抗原和粗制抗原,该方法的敏感性和特异性可接近95%。由于H.pylori的表型存在很大的异质性,制备细胞毒素的抗原要选择多株混合菌,特别应包括研究群体中的分离菌株。目前,市售的商品试剂盒有检测血清H.pylori全菌IgG抗体和毒素相关蛋白IgG抗体的试剂盒(图4-4)。
商品化试剂盒应用于新的人群时,不能简单相信说明书或以前使用的界值,特别是对进口试剂盒更是如此。因为新人群中感染的H.pylori菌株不同,其表面抗原可能也有差异,且与空肠弯曲菌等与H.pylori抗原有交叉反应细菌的接触情况也可能不同,需重新确定界值。此外,还有一种通过全血快速检测H.pylori的试剂盒,方法简便、快速,但其敏感性和特异性可能不如常规的血清学检测方法。
应用免疫印迹技术将H.pylori的不同组分转移至固相支持物上,再加入待检血清,该方法不仅可诊断H.pylori感染,还可同时对感染的H.pylori进行分型(图4-5)。
目前有一种由MP Biomedicals, LLC 公司开发的H.pylori快速检测试剂盒,应用现症感染条带(CIM)进行检测,CIM其本质是H.pylori特异蛋白,它是从cDNA库中筛选出的一个创新的重组蛋白,该试剂盒可作为H.pylori活动性感染初筛试验,如果病人检测阳性,并未经H.pylori根除治疗,应高度怀疑H.pylori活动性感染,医生可按规定对病人治疗。如果病人已经接受了H.pylori治疗,则该试剂盒不能被用作治疗效果H.pylori根除试验的检查,该试剂盒经亚洲人群和西方人群中多项研究表明其敏感度和特异性均>90%(图4-6)。
由于H.pylori具有高度活性的尿素酶,可分解尿素产生NH3和CO2,CO2在小肠上端吸收后进入血液循环,随呼气从肺排出。受试者口服同位素(13C或14C)标记的尿素后,如果胃中存在H.pylori,就可将同位素标记的尿素分解为同位素标记的CO2。收集受试者服药前后呼出的气体,检测呼气中同位素标记的CO2,即可诊断H.pylori感染(图4-7,图4-8)。由于口服的同位素标记尿素到达胃内呈均匀分布,只要在尿素接触的部位存在H.pylori,就可被灵敏的检测到。
尿素呼气试验分13C-尿素呼气试验和14C-尿素呼气试验。13C为一种稳定的同位素,不具有放射性,在自然界以特定的比例天然存在,对人体及环境均无任何危害。此外,尿素在人体内分布广泛,服用后不会有明显的副作用,因此13C-尿素呼气试验适用于所有年龄和类型的受试者,包括孕妇和儿童,并且可在短期内多次重复,无任何副作用。
14C-尿素呼气试验采用液闪计数仪检测受试者呼气中14C标记的CO2的放射性活度,较13C-尿素呼气试验价格便宜。本试验所用14C-尿素剂量很小,可适用于大多数的成人,但孕妇不适宜用此项检测。
尿素呼气试验要求受试者在空腹状态下检查,整个过程中要保持安静,剧烈运动后血中酸碱度的变化可能影响同位素标记的CO2的呼出,因此,运动后不宜进行该项检查。尿素呼气试验检测H.pylori具有较高的敏感性和特异性,文献报道其敏感性为95%,特异性为95-100%。与尿素酶试验、细菌培养和组织学检测方法不同,13C/14C-尿素呼气试验是对全胃H.pylori感染情况的判断,而上述侵入性的检测则仅是对胃镜活检部位感染情况的检测。目前认为,尿素呼气试验是诊断H.pylori感染的最佳方法,该方法操作简便、快速、准确、无创,检测阳性可确认现症感染,可用于治疗后判断H.pylori的根除效果。然而,胃内需有一定密度的细菌定植尿素呼气试验才可显示阳性,因此,对接受H.pylori根除治疗的病人,应于停药4周后进行此项检查;近期服用质子泵抑制剂、铋剂及抗生素将导致假阴性结果。
H.pylori粪便抗原(Helicobacter pylori stool antigen, H.pyloriSA)检测试验,是一种非侵入性诊断方法。由于H.pylori定居于胃上皮细胞表面,随着胃黏膜上皮细胞的快速更新脱落,H.pylori也随之脱落,并通过胃肠道从粪便排出,从而可以通过粪便来检测H.pylori。H.pylori粪便抗原检测试验能够特异性诊断人体内H.pylori的感染,同时可适用于婴幼儿以及有精神障碍的患者,该方法操作简便,省时,不需要昂贵的仪器,经过验证的单克隆抗体法检测具有较好的敏感性和特异性,文献报道其敏感度为90.0%~98.2%,特异度为75.0%~100%。目前,该方法已经在国际上被广泛推广使用[1-3]。国际共识认为该方法的准确性可与呼气试验媲美[4],但国内目前尚缺乏相应的试剂。
1.试验方法
目前应用于临床的H.pyloriSA检测方法主要有以下两种:
(1)酶联免疫分析双抗体夹心法(enzyme immunoassay, EIA),该方法需要酶标仪进行检测,完成试验约需要2个小时,需由专业技术人员来进行检测。
(2)基于横向流动色谱技术的H.pyloriSA免疫检测卡(lateral flow immunoassay, LFI),该方法操作更简便快捷,更人性化,5min即可快速免疫分析检测人粪便中的H.pylori抗原,由于该方法操作简单,甚至可以由患者自行进行检测,目前这种快速检测卡正在逐步取代上述EIA的方法[5-9]。(图4-9,ImmunoCard STAT! H.pyloriSA)
图4-9 幽门螺杆菌粪便抗原检测
2.适应症和注意事项
粪便抗原检测不需要患者口服任何试剂,只需留取粪便标本即可检测受检者是否存在H.pylori感染,因此本方法适用于所有年龄和类型的受检查者,无任何毒副作用。由于本法检测的是H.pylori抗原,因此可以反映现症感染情况,并可以用于治疗后复查,判断疗效,还可以用于大规模流行病学调查。受检查者如果在检查前服用过抗生素、铋剂或质子泵抑制剂等影响H.pylori检测的药物,由于H.pylori受到抑制可能会产生假阴性结果,为避免这种情况的发生,应在患者停药至少4周后进行检查。由于H.pyloriSA检测的是粪便中H.pylori抗原,当患者进行H.pylori根除治疗后,即便患者的H.pylori已经被根除,但在治疗结束4周时约有6%的患者粪便中仍然有可能被检测出H.pylori抗原,从而导致假阳性的结果,如果在采用本法进行疗效判断时,让患者在治疗结束后6~8周进行检测,则可以明显降低试验的假阳性率[10,11]。
在H.pyloriSA快速检测卡试验操作过程中应注意的问题:试剂必须置于4℃冰箱冷藏,在检测时应当使试剂在室温下放置20分钟左右,以保证实验在室温下进行,如果试剂在室温中放置过久可能会导致假阴性结果;在样品加入检测孔后5min即应读取结果,时间过长可能会导致假阳性结果;粪便性状对检测结果无明显影响,但粪便较稀时应注意挑取粪便中的有形成份,以免由于样品量不够导致假阴性结果;本试验为快速试验,收到标本后可以即刻检测,如不能立即对标本进行检测,应将标本贮存于-20℃冰箱,检测时应使标本恢复到室温后再进行检测,否侧可能导致假阴性结果。
H.pylori的全基因序列已经明了,设计合成与相应基因互补的核酸片断为引物或探针,进行体外基因扩增或杂交,直接检测H.pylori DNA,用于临床诊断可获得极高的敏感性和特异性,用于基础研究也可检测细菌的蛋白表达、致病机制及分子流行病学研究。
聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)是利用两条与靶DNA两端互补的寡核苷酸引物,在DNA聚合酶的作用下,合成特异性DNA片断的体外扩增技术。可用于PCR检测的临床标本有胃黏膜活检组织、脱蜡后的组织切片、胃液、牙菌斑、粪便等。尽管PCR对模板的要求不高,但很多快速提取法提取的DNA样品因杂质过多,对DNA聚合酶可能有抑制作用,使得结果的重复性较差。PCR检测H.pylori的敏感性和特异性虽然很高,但并非100%。应选择文献已经报道并经试验证实其特异性的引物;此外,假阴性多由于模板量过少或反应中存在Taq酶抑制剂,常见于检测粪便[1]、牙菌斑及组织切片标本时;假阳性则主要由于污染,特别是产物污染所造成的。
基于PCR的技术,如随机扩增的多态性DNA分析、PCR产物的酶切分析及单链构型多态性分析被用于H.pylori的分型鉴定,并区分不同来源的H.pylori。这些方法敏感、快速、具有稳定的可重复性,主要用于治疗后菌株复发和再感染的鉴别,特别在H.pylori感染的分子流行病学研究中具有重要价值。
实时荧光定量PCR(real-time PCR)技术近年来在H.pylori检测中的应用倍受关注,由于该技术实现了PCR从定性到定量的飞跃,与普通PCR相比特异性更强、并有效解决PCR污染问题、且自动化程度高,目前已成功的用于胃黏膜标本中的H.pylori特异基因(如尿素酶基因等)、耐药基因(如克拉霉素耐药相关23S rRNA突变位点等)及宿主CYP2C19酶基因多态性的检测。此类检测将在高H.pylori耐药水平地区开展个体化根除治疗时,被用于指导抗生素和质子泵抑制剂(PPI)药物的选择。
原位杂交是利用对H.pyloriDNA特异的基因探针,与待检标本杂交,从而检出H.pylori感染。所用的探针包括合成的寡核苷酸探针、克隆的H.pylori特定基因的标记探针、PCR扩增中掺入标记单核苷酸的到的产物探针。目前,原位杂交技术除用于H.pylori感染的诊断,更多的应用于基础研究中,如细菌与为黏膜关系的研究、治疗前后胃内细菌形态变异体的鉴定。
H.pylori的生物芯片检测技术主要包括DNA芯片检测技术和蛋白芯片检测技术,在本章节中有关非侵入性检测方法中对两种类型的芯片技术进行简要介绍。
1.幽门螺杆菌的DNA芯片检测:可以针对H.pylori的全基因组或某些特定基因进行设计,发挥高通量分析的优势,可以对H.pylori的标识基因、毒力基因等进行快速、大规模筛查,从而为菌种鉴定、基因分型、快速诊断等提供高效快捷的技术手段,能够对相关菌株特征在基因水平上有更全面的了解。
(1)幽门螺杆菌DNA芯片的主要技术特点:H.pyloriDNA芯片主要为将PCR扩增制备的探针或合成的寡核苷酸探针,以微点样的方式点样并固定在经表面修饰的特定固体介质表面制备而成,通过类似Southern杂交的方法与待测样品(经荧光素标记)进行杂交,经芯片扫描仪扫描,用软件将信号进行比较和分析,获得所需基因序列及其表达的大量信息。
(2)幽门螺杆菌DNA芯片的发展及临床应用:2000年斯坦福大学率先完成了包含H.pylori1660个基因探针的全基因芯片的研发工作[1],建立了今后H.pylori生物芯片的雏形、工作策略(包括样品准备、数据处理和分析等),也使人们对此类研究工作的工作量有了更深入的了解;斯坦福大学对H.pylori生物芯片的初步应用效果受到世人的广泛关注,发现所测定的15株菌中的共同基因有1281个,构成了H.pylori功能基因的核心部分;其它至少12~18%的基因为不同菌株所特有,首次在全基因水平上展示了H.pylori的高度变异性。也正是由于采用了生物芯片技术,使人们观察到了除cag毒力岛以外的其他高度变异区域等。
(3)幽门螺杆菌DNA芯片与相关研究:Joanne M.Cox[2]用高密度cDNA microarray技术研究H.pylori cag毒力岛阳性与阴性菌株诱导上皮细胞基因表达状况。结果发现15个新的cDNA及92个已知功能的基因有差异表达,这些基因编码生长因子、细胞因子及其受体、调亡蛋白、转录因子,从而可以更好地理解H.pylori的致病性。
从当前的研究资料看,我国各地人群所感染的H.pylori菌株的变异度很大,要全面了解我国H.pylori菌株,采用DNA芯片进行分析将是比较明智的选择;在此过程中有三个问题需充分注意:其一,尽可能在DNA芯片中加入更多的反映我国菌株特征的探针,这将是我们今后工作的重点之一;要获得我国H.pylori菌株特征基因,进行特异基因的发现、定位和收集将非常重要;其二,由于进行H.pylori的DNA芯片分析,虽可获得前所未有的重要资料,但毕竟是一项耗资巨大的工程,在选择代表菌株方面需非常慎重,以期达到事半功倍的效果;其三,要避免小而全的重复性研究,多单位联合攻关将是今后此领域工作唯一选择。国内尤元海等[3]自主设计了包含90000探针的CombiMatrix Custom寡核苷酸芯片,探针覆盖了6株H.pylori的全基因序列信息的DNA芯片,对8株来源于不同消化道疾病的H.pylori菌株进行分析,并发现了不同来源菌株在基因组水平的规律性差异,特别是胃癌来源菌株的基因组特征;这些特征在另外的76株不同来源菌株中获得了验证。
H.pyloriDNA芯片将不仅仅局限在对全基因的检测,可根据不同的目的,建立不同的微阵列模式,会对H.pylori的研究带来前所未有的便利和可能;其一,将会出现H.pylori基因分型DNA芯片,这部分芯片的侧重点在于观察细菌间的差异基因,因仅涉及数百个基因,可以使我们有能力在较大菌株群中进行观察;其二,H.pylori耐药性检测DNA芯片,主要针对H.pylori的耐药性基因(包括可能的突变位点等)进行设计,将为我国H.pylori菌株的耐药性分析提供高通量的分析手段。
由于H.pylori感染与人类胃癌发生关系的研究越来越受到重视,H.pylori与人胃黏膜上皮细胞的相互作用(包括相关细胞系的体外相互作用)将成为研究热点,人类表达谱芯片(已有多种商品化供应)将作为一种有效的手段用于分析感染对机体的复杂影响过程的一个重要侧面,此类研究在其他病原菌与机体相互作用研究中已有许多成功的范例。相信通过我国H.pylori协作组成员单位的通力合作,借助各方力量和生物芯片方法,必将使我们在H.pylori相关研究领域在国际上占有一席之地。
2.幽门螺杆菌的蛋白芯片检测:
(1)幽门螺杆菌蛋白芯片的主要技术特点:通过免疫蛋白组学研究发现,H.pylori标准株26695的14种抗原性蛋白质在十二指肠溃疡和胃癌患者的识别模式有显著差异[4]。通过传统的Western blotting发现H.pylori的一个19KD的蛋白与黏膜相关淋巴组织瘤相关[5]。基于大规模的流行病学数据,某些被认为是与特定感染临床结果相关的H.pylori潜在毒力因子被质疑[6,7]。蛋白质组研究中发现9种H.pylori蛋白可能是胃癌相关蛋白,2种可能是非胃癌相关蛋白。H.pylori白芯片的组成特点,就是具体的诊断或分析目的,将多种H.pylori蛋白或对应的抗体成分,分别固定在芯片片基上,已达到同步检测多重H.pylori抗原或抗体成分的目的;近期发展的H.pylori蛋白芯片将主要体现出两个主要技术特点;其一,目的明确,往往将对H.pylori的检测与对机体相关生物标记物的检测(如增加对胃癌相关的胃蛋白酶原I、胃蛋白酶原II及其比例检测)整合进行;其二,表现出对抗原或抗体的准确定量能力。
(2)幽门螺杆菌蛋白芯片的发展及临床应用:目前主要用于对血液中相应成分的分析,不久的将来,将可用于对粪便抗原、尿液成份分析,已经用于对H.pylori菌株或H.pylori与上皮细胞相互作用分析。
(3)幽门螺杆菌蛋白芯片与相关研究:有关H.pylori蛋白芯片,在我国具有广泛应用于人群感染H.pylori菌型调查有关研究的巨大潜力和可行性,必将受到重视;在未获得足够的蛋白样品用于相关蛋白芯片制备之前,利用2D技术对标准菌株抗原进行展开,暂时替代生物芯片进行应用,在研究中会发挥重要作用;特别是近年来在采用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术对H.pylori菌株进行分析鉴定时,该技术表现出良好的对国内外H.pylori菌株的区分能力,进一步解析将对实用化的H.pylori蛋白芯片的发展具有重要意义。
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